Koyun orijinli polimorf nükleer lökositlerde toxoplasma gondii'ye karşı şekillenen hücre dışı tuzağın kantitatif analizinde picogreen ve sytox orange boyalarının karşılaştırılması

Abstract

Toxoplasma gondii dünya çapında yaygın, zorunlu hücre içi zoonoz parazitik protozoondur. Vücuda giren patojenlere karşı canlıda ilk savunma hattını doğal bağışıklık yanıtı oluşturmaktadır. Bu yanıtın en önemli unsurlarından birisi polimorf nükleer lökositlerdir (PMN). PMN'i oluşturan hücrelerin büyük çoğunluğu nötrofillerdir. Nötrofil vücutta patojenle mücadelede fagositosis, degranülasyon ve netosis stratejilerini kullanır. Patojenle karşılaşan PMN'de şekillenen bir dizi reaksiyon sonrasında çekirdek ve granüler içerikler ağ biçiminde hücre dışı alana salınmaktadır. Bu tuzak yapılarınının kantitatif analizinde çeşitli DNA boyaları kullanılmaktadır. Bu tez çalışmasında koyun PMN'inde T. gondii takizoitlerine karşı in vitro şekillenen hücre dışı tuzak yapılarının omurgasını oluşturan DNA'nın kantitatif ölçümünde iki ekstraselüler DNA boyasının (Sytox orange ve Picogreen) etkinliğinin karşılaştırılması amaçlanmıştır. Çalışma kapsamında koyunlardan izole edilen PMN ve T. gondii takizoitleri farklı sürelerde (30, 60, 90 ve 120 dakika) inkübe edilmiş ve reaksiyon sonucunda açığa çıkan ekstrasellüler DNA iki farklı boya ile boyanarak ölçülmüştür. Çalışma sonucunda 30 dakikalık inkubasyon dışındaki (p=0.014) inkubasyon sürelerinde açığa çıkan DNA'nın ölçümü bakımından iki boya arasında istatistiksel fark bulunmamıştır (p>0.05). İki boya arasında 30. dakikadaki boyanma farklılığı önemli bulunmuştur. Bu durumun sebebinin kullanılan boyaya ait boyama özelliği ile ilgili olabileceği düşünülmüştür. In vitro netosis çalışan araştırıcıların kısa süreli inkubasyon sonucunda şekillenen ekstrasellüler DNA'nın kantitatif analizinde iki farklı boya kullanmaları önerilmiştir.

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular zoonotic parasitic protozoan that is common in the world. Innate immunity is the first line of defense of host against pathogens entering the body. One of the most important cells of innate immunity is the polymorphonuclear leukocytes (PMN's). Neutrophils consist the majority of the PMN. Neutrophil uses several strategies including phagocytosis, degranulation, and netosis while it is fighting the pathogen in the body. Upon encountering with a pathogen, a series of reactions occur inside of PMN, then, nucleus and granular contents release extracellular area like as network structures. Various extracellular DNA dyes are used for the quantitative analysis of these trap structures. The aim of the thesis study was to compare the effectiveness of two extracellular DNA dyes (Sytox orange and Picogreen) in quantitative measurement of the DNA that forms the backbone of the extracellular trap structures released from sheep PMN's after confronted with T. gondii tachyzoites in vitro. In the study, T. gondii tachyzoites and PMN's isolated from the sheep were incubated at different times (30, 60, 90 and 120 min), and then extracellular DNA released after incubation was stained with two different dyes. There was no statistical significant difference between the two extracellular DNA dyes regarding the measurement of DNA released during incubation times (p>0.05), except for the 30-minute incubation time in the present study. There was a statistically significant difference at 30 minutes incubation time (p=0.014). It is thought that this may be explained by the staining properties of the dye. Researchers studying in vitro netosis are recommended to use two different extracelluler DNA dyes for the quantitative analysis of extracellular DNA formed during short-term incubation.