Adipoz kök hücreden farklılaştırılmış kondrositlerin aljinat temelli mikrokürelerde enkapsülasyonu

Abstract

Doku mühendisliği biyoloji bilimlerini mühendislik ilkeleriyle birleştiren, hasara uğramış dokuların fonksiyonlarını geri kazanması amacıyla biyolojik bileşenlerin üretilmesi ve geliştirilmesi olarak tanımlanmaktadır. Kıkırdak doku mühendisliği modeliyle yapılan çalışmalarda hasarlı kıkırdak dokusuna, çeşitli fizikokimyasal yöntemlerle elde edilen polimerik iskelet yapılarınını üstüne istenilen sayıda hücre ekilerek implantasyonu hedeflenmektedir. Elde edilen polimerik iskelet yapıları, ekimi yapılan hücrelere hem mekanik destek hem de hücrelerin üzerlerinde tutunup çoğalabilecekleri üç boyutlu fiziksel ortam sağlamaktadırlar. Bu çalışmanın amacı, çeşitli hayvanlardan izole edilen in-vitroda kondrosite farklılaştırılan adipoz kök hücrelerin ve kondrositlerin, aljinat mikroküreler içerisinde hücresel canlılıklarını ve kendine özgü morfololojilerini aljinat doku iskelesine ve tek tabaka flask kültürüne göre daha iyi koruduğunu göstermektir. Koyunların lumbal bölgesinden elde edilen adipoz kök hücrelerin kondrosite farklılaştırılması in-vitro flask kültürlerinde gerçekleştirilmiş, 3. pasaj sırasında mikrokürelere ekimleri yapılmıştır. Koyunların artiküler bağ dokusundan elde edilen kondrosit hücreleri de kültüre edilip hem mikrokürelere hem de doku iskelelerine ekimi yapılmıştır. Aljinat mikroküre yapılarını elde etmek için %2'lik aljinat ve %2 aljinat-%1 hyaluronik asit karışımı 6x10^5 tane/ml kondrosit içeren 100 mikrolitre besiyeriyle karıştırılmış, sonrasında 23G bir şırıngadan CaCl2 çözeltisi içerisine damlatılıp çapraz bağlanmıştır. Aljinat doku iskelesi yapısı elde etmek için ise %2'lik aljinat çözeltisi %0,3'lük kitosan çözeltisi ile 5'e 2 oranında karıştırılmış sonrasında CaCl2 ile çapraz bağlanmış, 2 gün boyunca -80 0C'de dondurucuda bekletildikten sonra liyofilize edilip %70'lik alkolle sterilize edildikten sonra üzerlerine 6x10^5tane/ml kondrosit ekilmiştir. Koyunlardan elde edilen adipoz kökenli kök hücreler, antikor boyaması ve glikozaminoglikan (GAG) işaretleyicileri (marker) ile işaretlenerek kök hücre oldukları gösterilmiştir. Kök hücreler StemPro kondrojenik farklılaştırma ortamında yaklaşık 7-14 gün içerisinde kondrosit hücresine farklılaştırılmış, antikor boyaması ile gösterilmiştir. Ayrıca mikroskobik gözlemlerle kondrositten fibro-bağ farklılaşması (dedifferansiyasyon) gösterilmiştir. Sonrasında 3. pasaj sonrası kondrosit hücreleri aljinat mikrokürelere enkapsüle edilerek orijinal morfolojilerini geri kazanmış ve mikroküreler içinde hyalin kıkırdaktaki kondrositlerin sentezlediği kondroidin sülfatı yeniden sentezlemeye başladıkları Toluidine Mavisi boyaması ile gösterilmiştir. Son olarak koyundan izole edilen ve flask kültüründe çoğaltılan kondrosit hücreleri hem aljinat mikrokürelerde enkapsüle edilerek hem de aljinat doku iskeleleri (skaffold) üzerine ekilerek Alamar Blue testi ve mikroskop görüntüleriyle hücre canlılığı açısından karşılaştırılmış, çıkan sonuçlar bize mikroküre enkapsülasyonu tekniğininin, doku iskelesine ekim tekniğine ve düz flask kültürüne göre kondrosit hücrelerini orijinal morfolojilerine daha yakın bir görünümde olmalarını ve daha yüksek metabolik aktivite göstermelerini sağladıklarını göstermiştir. Elde edilen sonuçlarara göre kondrositlerin hücresel ekstrasellüler matriks bileşenlerinin kıkrdak dokusuna iletimi açısından aljinat mikrokürede enkapsülasyon tekniğinin, aljinat doku iskelesine ekim tekniğine nazaran daha etkili bir hücresel ilaç iletim mekanizması olduğu sonucuna varılmıştır. Ayrıca her iki aljinat polimerleşme tekniğinde de hidrojellerden flask kültür tabakasına besiyeri ortamında herhangi bir kondrosit hücresi aktarılmadığı görülmüştür. Enzimatik hidroliz uygulamalarıyla kondrositlerin mikrokürelerden geri elde edim teknikleri in-vitroda ve in-vivo çalışmalarla geliştirilebilir.

Tissue engineering combines biological sciences with engineering principles, aims to regenerate damaged tissues by producing and improving biological substances such as cells, growth factors, signalling molecules and polymeric matrices. It is possible, regenerating damaged cartilage tissue via cartilage tissue engineering model by inoculating desired cell population into produced polymeric matrixes with desired shape and geometry. These polymeric matrixes provides cells to be easily attached and proliferate on and mechanical stability. This study aims to demonstrate chondrogenic potential of adipose derived stem cells taken from rabbit and sheep adipose tissue in alginate micropheres comparing with alginate-chitosan scaffold and monolayer flask culture by measuring cell viability and morphology. Adipose derived stem cells isolated from lumbal region of sheeps are identified with antibody and glycosaminoglycan (GAG) markers. Then they cultured in flasks using StemPro chondrogenesis differentiation kit for 14 days. After the 3rd passage dedifferantiated chondrocytes are encapsulated in alginate microspheres and also inoculated into alginate-chitosan scaffolds. Alginate microspheres are fabricated by dropping %2 alginate with 6x105 cells/ml by drop-weight method into %10 CaCl2 with a 23G syringe nozzle. Alginate-chitosan scaffolds are fabricated by mixing %2 alginate with %0,3 chitosan with a ratio of 5/2 in pH 4.5. The mixture electrostatically mixed with %10 CaCl2, lyophylized for two days and sterilized with %70 alcohol. 6x10^5 cells/ml chondrocytes inoculated onto scaffold and cultured. After cultivation chodrocytes shows sphrerical morphology on both alginate micropsheres and lyophilized scaffolds. Chondrocytes in microshperes and scaffolds synthisized hyaline cartilage oligomatrix chondoritine sulphate protein shown by Toluidine Blue dye. Fresh chondrocytes isolated from rabbits encapsulated in alginate micropheres, and inoculated in alginate-chitosan scaffolds then cultured. These are compared for cell metabolic activity and cell morphology by using Alamar Blue test and microscop view. According to the results, chondrocytes encapsulated in alginate microspheres shows more metabolic activity and more spherical morphology then alginate-chitosan scaffold and monolayer flask culture. It is possible to say that for cartilage tissue engineering model, alginate microspheres shows more promises about implantation efficiancy.