siRNA yüklü nanopartiküllerin in vitro ortamda MDA-MB-231 kanserli hücre hattına aktarılarak Bcl-2 geninin sessizleştirilmesi

Abstract

Kanser tedavisinde halen uygulanmakta olana kemoterapi, radyoterapi ve cerrahi tedavi uygulamalarındaki yeni gelişmelere rağmen bu tedavilerin hastaların yaşam süresine olumlu katkıda bulunduğuna dair hâlâ genel kabuller oluşmamıştır. Şimdiye kadar uygulanan kemoterapi protokollerinde objektif cevap oranı %20 civarında olup, tüm kemoterapi alan grupta ortalama yaşam süresi destek tedavisi alan gruplarla benzer olmaktadır. Ancak kemoterapiye cevap veren %20'lik grupta yaşam süresi ortalama 20-24 aya kadar uzamaktadır. Kemoterapinin yüksek doz verilmesinin ve intraplevral kullanılmasının ek bir tedavi katkısı sağlamadığı da bilinmektedir. Yeni bir teknoloji olan gen tedavisi, genel çerçevede "mevcut hastalığa neden olan gen bozukluğunun tedavisi amaçlanarak belli bir DNA'nın diğer bir hücreye isteyerek taşınması" şeklinde tanımlanabilir. Yeni ribonükleik asit (RNA)'lerin bulunması ve işlevlerinin tanımlanmasıyla, RNA'ların canlı yaşamı için çok önemli süreçlerde rol oynadıkları belirlenmiştir. Özellikle insan genomunun %62'sini (ENCODE Consortium) kapsayan ncRNA (kodlamayan RNA)'ların hücresel savunmada, gelişimsel süreçlerde, farklılaşmada, DNA replikasyonunda, transkripsiyonda ve post-transkripsiyonel susturumda görev aldıkları gösterilmiştir. ncRNA'larda meydana gelen bozukluklar birçok hastalığa yol açmaktadır. İlişkili oldukları hastalıklardan bazıları kanserler, nörodejeneratif hastalıklar, immün yetmezlik hastalıkları ve kardiyovasküler hastalıklardır. Hastalıklardan sorumlu oldukları düşünülen ncRNA'lar, yeni tedavi yaklaşımlarında hem hedef hem de araç olarak görülmektedirler. İnsan genomundaki tüm ncRNA'ların işlevlerinin aydınlatılmasıyla yeni tedavi yaklaşımları geliştirilebilecektir. Bu çalışmanın amacı meme kanseri tedavisi için zararlı proteinlerin sentezinin ilgili genin sessizleştirilmesi ile önlenmesidir. Histidinle pozitif yük kazandırılmış hema bazlı nanopartikül (PHEMAH; poli (hidroksietil metakrilat-N-metakrilol-(L)-histidin) ile siRNA'nın MDA-MB-231 meme kanser hücre hattına aktarılarak Bcl-2 geninin ekspresyonunu önleyerek apoptozu artırmaktır. Çalışmanın ilk bölümünde Histidinle pozitif yük kazandırılmış hema bazlı nanopartiküllerin zeta-sizer'da boyutları ve yükleri ölçülmüş daha sonra siRNA'ya bağlanan nanopartiküllerin elektroforezi yapılmış, bu değerlendirmeler sonucunda nanopartikül ile siRNA'ların tutunup tutunmadığı kontrol edilmiştir. Çalışmanın ikinci bölümünde ise; meme kanseri hücre hattı olan MDA MB-231 üzerine siRNA yüklü PHEMAH nanopartiküller eklenmiş ve nanopartiküllerin kanser hücreleri üzerindeki etkilerine bakılmıştır. RTCA ile hücrelerin hücre yaşam indeksleri belirlenmeye çalışılmıştır. MTT testi yapılarak hücre ölümüne bakılmıştır. Ölen hücrelerin apopototik-nekrotik yolaklardan hangisini seçtiğinin belirlenmesi için hücreler boyanarak floresan mikroskop yardımıyla incelenmiştir. Elde edilen sonuçlar, siRNA yüklü PHEMAH nanopartiküllerinin Bcl-2 genini inhibe ederek meme kanseri hücrelerinde etkin bir şekilde proliferasyonu durdurduğu görülmüştür.

Despite the new approach of the chemotherapy, radiotherapy and surgical treatment which are still applicated on cancer therapy, there is no evidence about that this treatments contribute to lifespan of patients positively. Until now, objective response rate is around 20% in chemotherapy protocols, and lifespan of a group of patients which take a chemotherapy is similar to group of patient which take a support treatment. However, lifespan of the 20 percent of person who response the chemotherapy is extend to aproximately 20-24 months. It is also known that, high dose of chemotherapy and it's intrapleural using does not contribute to treatments. Gene therapy, which is a new technology, can desciribed as proggrammed transmision of specific DNA to the other cell with the targeting of the gene disorder treatment which causes existing disease. Discovering of the new RNA's and identifing of it's functions, it is determined that RNA is play an important role for live life. İt is shown that especially ncRNA (non-coding RNA) which covers 62% of human genome (ENCODE consortium) takes a role in cellular defence, developmental process, differentiation, DNA replication, transcription and post-transcriptional silencing. Many disorders occuring in ncRNAs lead to many diseases. Some of the diseases that are associated with cancer, neurodegenerative diseases, immune deficiency diseases and cardiovascular diseases. ncRNA believed to be responsible for diseases are seen as new treatment approaches both target and tools. New treatment approaches can be developed with the lightening of all functions of ncRNAs in human genome. The aim of this study is preventing of synthesise of harmful proteins for breast cancer treatment with silencing of the related gene. Increasing the apoptosis with preventing the expression of Bcl-2 gene with transmising of siRNA to breast cancer cell line MDA-MB-231 with Hema-based nanoparticules which have gained positively charge with histidine ( PHEMAH; poly (hydroxyetil metacrylate-N- metacrylole-(L)-histidine). At the first part of the study, the size and charge of Hema-based nanoparticules which have gained positively charge with histidine was measured with zeta sizer and then electrophoresis of siRNA loaded nanoparticules which are bounded siRNA was done. As a result of this assesments, wheather nanoparticules and siRNA are bounded was controlled. At the second part of the study, siRNA loaded PHEMAH nanoparticules were added on MDA-MB-231, which is breast cancer cell line, and the effect of the nanoparticules on cancer cells was observed. Cell viability index was identified with Real Time Cell Analysis (RTCA). Cell death was observed with MTT test. For determine the Apopototic-necrotic pathway of died cells, staining was done and analyzed by fluorescence microscopy. Obtained results showed that, proliferation of Bcl-2 gene at breast cancer cells was hindered effectively with inhibition of Bcl-2 gene with siRNA loaded nanoparticules.