An in vitro investigation of the interaction of genomic dna with some copper compounds

Abstract

Genomik DNA, bir organizmanın toplam genetik bilgisini oluşturmakta olup, transkripsiyon, rekombinasyon, hücre sağ kalımı ve çoğalması gibi canlılık için gerekli süreçlere temel teşkil eder. Normal fizyolojik koşullar altında, K+, Na+ ve Mg+ gibi katyonlar, elektrostatik etkileşim yoluyla genomik DNA'nın normal işleyişine ve stabilitesine katkıda bulunurlar. Metal iyonlarının, DNA stabilitesini ve yapısını koruma rolleri bilinmekle birlikte, bazıları ise mutajen ve kanserojen etkili olabilmektedir. Canlı organizmalarda, DNA ile fizyolojik sınırların üzerinde etkileşime giren geçiş metalleri, geri dönüşü olmayan hücre hasarına ve nihayetinde hücre ölümüne yol açabilir. Diğer yandan, başta anti-kanser ajanlar olmak üzere genomik DNA'nın aktivitesini değiştiren veya inhibe eden yeni terapötik ajanların keşfedilmesini amaçlayan bilimsel çalışmaların sayısı her geçen gün artmaktadır. Çevresindeki kimyasal ajanlarla kurduğu bağlar DNA'nın aktivitesini kritik bir şekilde etkilemekte olup, DNA'nın metal bileşikleriyle etkileşiminin araştırılması, etkili terapötik ajanların ve daha iyi ve güvenli anti-kanser ilaçların tasarlanmasına katkıda bulunmaktadır. Bu çalışmada, genomik DNA'nın çeşitli konsantrasyonlardaki (1000 ?M, 500 ?M, 250 ?M, 125 ?M ve 62,5 ?M) bazı bakır bileşikleri (CuSO4, CuCO3 ve CuCl2) ile etkileşiminin araştırılması; UV-VIS absorbans spektrofotometri, agaroz jel elektroforezi ve floresan spektrofotometri teknikleri ile gerçekleştirildi. Araştırmamız kapsamında, söz konusu biyokimyasal analiz teknikleri kullanılarak yapılan tüm ölçümler, sabit genomik DNA ve değişken bakır bileşikleri konsantrasyonları üzerinde yapıldı. Bu çalışmada kullanılan genomik DNA, buzağı timüsünden izole edildi. İzole edilen ve 260/280 nm'de 1.84 saflığa sahip olan genomik DNA; UV-absorbans, agaroz jel elektroforezi ve floresan spektrofotometri çalışmalarında kullanıldı. DNA-bakır bileşiği karışımları, steril eppendorf tüplerinde 1:1 oranında (5 ?l + 5 ?l) hazırlandı. Bu işlemi takiben, tüm kombinasyonlar 37°C'de 60 dakika süreyle inkübe edildi. DNA, bakır bileşiği ve DNA+bakır bileşiği örneklerinin UV-absorbans ölçümleri spektrofotometre cihazı ile gerçekleştirildi. Cihaz kalibrasyonu ve ölçümlerde nükleaz içermeyen saf su tercih edildi. Floresan spektrofotometri çalışmalarında ise DNA, DNA oyası, bakır bileşikleri ve DNA+bakır bileşiklerinin floresan yoğunluğu, çok modlu bir mikroplaka okuyucu ile 290 nm eksitasyon değerinde ve 400-700 nm emisyon aralığında ölçüldü. Agaroz jel elektroforezi için 10 µl DNA+bakır bileşiği 2 µl DNA yükleme boyası ve 2 µl DNA boyası kullanıldı. Yükleme işleminin ardından 100 voltta 1,5 saat elektroforez işlemi gerçekleştirildi. UV-VIS spektrofotometri verileri incelendiğinde 220-320 nm absorbans aralığında konsantrasyon ile orantılı olmak üzere CuCl2'ün hiperkromik etkisi belirlendi. CuCl2 DNA ile en güçlü etkileşimi 220-320 nm absorbans aralığında 1000 ?M dozda gerçekleştirdi. Aynı absorbans aralığında 1000 ?M konsantrasyonda CuSO4 ve CuCO3 de DNA pikinde en büyük hiperkromik etkiyi oluşturdu. Floresan spektrofotometri verileri incelendiğinde bakır bileşiklerinden CuCl2'nin 1000 µM konsantrasyonda 400-700 nm aralığında oluşan hipokromik etkisi belirlendi. CuSO4 bileşiği ise 62,5 ?M üzerindeki konsantrasyonlarda hipokromik etki (400-700 nm) gösterdi. Ancak bu etki derişimle orantılı olmayıp en güçlü hipokromik etki 125 ?M CuSO4 konsantrasyonunda ortaya çıktı. CuCO3'ün floresan spektrofotometri verileri değerlendirildiğinde ise çalışmamız kapsamında incelenen konsantrasyonlarda DNA ile etkileşmediği belirlendi. Agaroz jel elektroforezi bulgularımız araştırılan üç bakır bileşiğinin de DNA bant yoğunluklarında konsantrasyon ile artış gösteren bir azalmaya sebebiyet verdiğini ortaya koydu. Bant yoğunluklarındaki en belirgin azalmaya (29,762) 1000 µM konsantrasyonundaki CuCl2'nin sebep olduğu gözlendi. Yine 62,5 µM konsantrasyonundaki CuCl2, 49,757 bant yoğunluğuna sahip kontrol DNA'sından sonra en yüksek bant yoğunluğunu (44,276) gösterdi. CuSO4 da en düşük bant yoğunluğunu 1000 µM'de (36,414) ve en yüksek bant yoğunluğunu 62,5 µM'de (40,139) gösterdi. Aynı şekilde CuCO3 1000 µM'de en düşük bant yoğunluğunu (39,980) ve 62,5 µM'de en yüksek bant yoğunluğunu (42,979) gösterdi. Agaroz jel elektroforezi görüntüleri incelendiğinde araştırma kapsamındaki bakır bileşiklerinin 62,5-1000 ?M konsantrasyon aralığında genomik DNA bantlarında herhangi bir bölünmeye neden olmadığı tespit edildi. Mevcut çalışmanın sonuçları bir arada değerlendirildiğinde, araştırılan bakır bileşiklerinin, interkalatif olmayan (oluk) bağlanma yoluyla DNA'ya bağlandığı sonucuna ulaşılmıştır. Bu sonuç, araştırılan bakır bileşiklerinin yeni terapötik ajanların geliştirilmesinde kullanılma potansiyeline sahip olabileceğini ortaya koymaktadır. Tespit edilen potansiyel etkinin yeni araştırmalara temel oluşturabileceği ve bu bileşiklerin kanser hücre hatlarında araştırılmasının faydalı olacağı sonucuna varılmıştır.

Genomic DNA constitutes the total genetic information of an organism and it is the basis for processes necessary for life such as transcription, recombination, cell survival, and proliferation. Under normal physiological conditions, cations such as K+, Na+, and Mg+ contribute to the normal functioning and stability of genomic DNA through electrostatic interaction. Although the roles of metal ions in protecting DNA stability and structure are known, some of them can be mutagenic and carcinogenic. In living organisms,transition metals that interact with DNA above physiological limits can lead to irreversible cell damage and ultimately cell death. On the other hand, the number of scientific studies aiming to discover new therapeutic agents that change or inhibit the activity of genomic DNA, especially anti-cancer agents, is increasing day-by-day. The bonds it forms with chemical agents in its environment critically affect its activity and investigating the interaction of DNA with metal compounds contributes to the design of effective therapeutic agents and better and safer anti-cancer drugs. In this study, to investigate the interaction of genomic DNA with some copper compounds (CuSO4, CuCO3, and CuCl2) at various concentrations (1000 ?M, 500 ?M, 250 ?M, 125 ?M, and 62.5 ?M); UV-VIS absorbance spectrophotometry, agarose gel electrophoresis and fluorescence spectrophotometry techniques were used. When the UV-VIS spectrophotometry data were examined, the hyperchromic effect of CuCl2 was evaluated to be proportional to its concentrations, within the absorbance range of 220-320 nm. CuCl2 had the strongest interaction with DNA at 1000 ?M. Within the same absorbance range, CuSO4 and CuCO3 also produced their strongest hyperchromic effect on the DNA at 1000 ?M. When the fluorescent spectrophotometry data were evaluated, the hypochromic effect of CuCl2 within the wavelength range of 400-700 nm was determined at 1000 µM. CuSO4 showed a hypochromic effect (400-700 nm) at concentrations above 62.5 ?M. However, this effect was not proportional to its concentrations, and the strongest hypochromic effect occurred at 125 ?M. Upon evaluating the fluorescent spectrophotometry data, it was observed that CuCO3 did not interact with DNA at the concentrations examined within the scope of this study. According to the agarose gel electrophoresis findings, all the three copper compounds investigated caused a decrease in DNA band intensities as their concentrations increased. It was observed that the most significant decrease in band intensities was caused by CuCl2 at 1000 µM. When the agarose gel electrophoresis images were examined, it was observed that the copper compounds within the scope of the study did not cause any cleavage in the genomic DNA within the concentration range 62.5-1000 ?M. After evaluating the results of the study, it was concluded that the investigated copper compounds bind to DNA via non-intercalative (groove) binding. This result reveals that the investigated copper compounds may have the potential to be used in the development of new therapeutic agents. In conclusion, the potential effect detected could form the basis of new research and it would be beneficial to investigate the effect of these compounds on cancer cell lines.