Kırıkkale yöresinde sığırlarda theileria annulata ve theileria buffeli/orientalis'in PCR-Reverse line blotting yöntemi ile araştırılması

Abstract

Theileria türleri başta sığırlar olmak üzere çeşitli evcil ve yabani ruminantlara Ixodidae ailesine bağlı kene türleri ile nakledilen zorunlu hücre içi parazitlerdir. Sığırlarda bu türlerden T.annulata, T.parva, T.buffeli/orientalis, T.mutans, T.taurotragi ve T.velifera enfeksiyon oluşturur. T.annulata ve T.parva en patojen iki türdür. Türkiye'de bu türlerden Tropikal theileriosis etkeni olan, yüksek morbidite ve mortaliteye sahip T.annulata, düşük patojeniteli veya apatojen bir tür olarak kabul edilen T.buffeli/orientalis varlığı bildirilmiştir. Theileria annulata ülkemizde hemen hemen her bölgede bulunmakta ve ülkemiz hayvancılığında önemli ekonomik kayıplara sebep olmaktadır. T.buffeli/orientalis ise ülkemizde moleküler çalışmaların başlamasıyla birlikte varlığı belirlenmiş olan bir türdür.Theileriosis teşhisi akut olgularda klinik belirtiler ışığında Giemsa ile boyanmış kan ve lenf yumrusu frotilerinin mikroskobik bakısı ile yapılmaktadır. Latent seyreden enfeksiyonların tanısında uzun yıllar serolojik yöntemlerden yararlanılmıştır. Direkt parazit DNA'sını saptamaya yarayan moleküler metodların gelişmeye başlamasıyla birlikte bu etkenlerin varlığı, tür teşhisi ve yaygınlığının ortaya konmasında bu yöntemlere başvurulmuştur. Son yıllarda bir defada kanda bulunan tüm kan parazitlerini teşhis etmeyi sağlayan, PCR ile hibridizasyonun birlikte kullanıldığı reverse line blotting (RLB) yöntemi kullanılmaya başlanmıştır.Bu tezde RLB yöntemi kullanılarak Kırıkkale yöresinde sığırlarda, daha önce ülkemizin çeşitli bölgelerinde tespit edilen T.annulata ve T.buffeli/orientalis'in varlığının ve yaygınlığının araştırılması ve yöntemin mikroskobik muayene ile karşılaştırılması amaçlanmıştır. Örnekler Mayıs 2010-Ekim 2010 tarihleri arasında Kırıkkale'nin 9 ilçesinden (Kırıkkale Merkez, Bahşılı, Balışeyh, Çelebi, Delice, Karakeçili, Keskin, Sulakyurt ve Yahşihan) 294 sığırdan toplanmıştır. Ulaşılan her hayvandan kulak ucundan alınan kandan yayma kan frotisi hazırlanıp, vena jugularis'ten EDTA'lı tüplere kan alınmıştır. Örnek alınan hayvanların 1 yaş üzerinde olması ve en az 1 mera sezonunu geçirmiş olmasına dikkat edilmiştir. Yayma kan frotileri Giemsa ile boyanarak ışık mikroskobu altında Theileria spp. piroplasmalarının varlığı yönünden muayene edilmiştir. Pozitif bulunan örnekler fotoğraflanmıştır. EDTA'lı tüplere alınan kanlardan DNA ekstraksiyonu yapılarak RLB işleminde kullanılmıştır.Çalışma sonucunda mikroskobik bakıda 294 örneğin 44 tanesinde (%15) Theileria spp. piroplasmaları, RLB'de ise 77 tanesinde (%26.1) T.annulata saptanmıştır. Alınan örneklerin hiç birinde T.buffeli/orientalis tespit edilmemiştir. Theileria spp. ve T.annulata'nın en yaygın olduğu ilçe Keskin ilçesi olarak belirlenmiştir.Bu çalışma Kırıkkale'de Theileria türlerinin varlığı ve yaygınlığının belirlendiği ilk çalışmadır. Çalışma sonunda, bölge sığırlarında T.annulata türünün var olduğu, T.buffeli/orientalis'in ise bulunmadığı tespit edilmiştir.Anahtar Sözcükler: Kırıkkale, mikroskobik bakı, RLB, Theileria annulata, Theileria buffeli/orientalis, yaygınlık

Theileria species are obligate intracellular parasites of various wild and domestic ruminants, especially cattle, and are transferred by species of ticks under Ixodidae family. Among these species, T.annulata and T.parva being the most pathogenic, T.buffeli/orientalis, T.mutans, T.taurotragi and T.velifera are infectious for cattle. T.annulata, the cause of Tropical theiloriosis with a high morbidity and mortality rate and a low pathogenic or an apathogenic species T.buffeli/orientalis have been reported from Turkey. While T.annulata is found throughout Turkey and has long been associated with economical losses in animal husbandry, T.buffeli/orientalis was only recognized with introduction of molecular techniques.In acute cases, with the light of clinical signs diagnosis of theileriosis is done with microscopic inspection of either Giemsa stained blood or lymph smears while in latent cases, serological methods has long been used. With development of techniques that directly targets the DNA of the parasite, molecular methods have been being used for determination of prevalence, identification and presence of these species. Lately, reverse line blotting (RLB) that consists of a PCR and hybridization step and is capable of detecting all blood parasites at once has been introduced.In this thesis, determination of prevalence and presence of T.annulata and T.buffeli/orientalis species, that were previously been reported from various parts of Turkey, in cattle from Kirikkale province, using RLB and its comparison to microscopic inspection was aimed. Samples were collected between May-October 2010 from 294 cattle in 9 districts of Kirikkale (Center, Bahsili, Baliseyh, Celebi, Delice, Karakecili, Keskin, Sulakyurt and Yahsihan). From each cattle that is over one year old of age and has at least been once in grazing season, a blood smear from ear tip peripheral blood was prepared and a venal blood sample from vena jugularis was drawn into tubes with EDTA. Blood smears were inspected and documented for the presence of Theileria spp. piroplasms after Giemsa staining. Venal blood samples were used for extraction of DNA for RLB.From 294 samples taken into analysis, a total of 44 (15%) Theileria spp. piroplasms were found with microscopic inspection while 77 (26.1%) harbored T.annulata as determined by RLB. None of samples harbored T.buffeli/orientalis. Keskin district showed the highest prevalence for Theileria spp. and T.annulata.This is the first study that shows the prevalence and presence of Theileria species in Kirikkale and it was determined that while T.annulata is present in the cattle of the province T.buffeli/orientalis is not.Keywords: Kirikkale, microscopic inspection, prevalence, RLB, Theileria annulata, Theileria buffeli/orientalis