Sığırlarda tulatromisin ve gamitromisinin trakea düz kasının kasılması ile trakea epitel hücreleri üzerine apoptotik, nekrotik ve sitotoksik etkilerinin araştırılması

Abstract

Bu çalışmanın amacı, tulatromisin ve gamitromisinin izole organ banyosu sisteminde in vitro sığır trakea kası üzerine ve sığır trakea epitel hücreleri üzerine apoptoz, nekroz yapıcı etkilerinin ve sitotoksik etkilerinin araştırılmasıdır. Çalışma 2 aşamalı olarak yapıldı. Öncelikle mezbahadan alınan sığır trakeası şerit tarzında kesilerek izole edildi ve izole organ banyosuna asıldı. Gamitromisin ve tulatromisin için kümülatif doz- cevap eğrisi alındı. Dokular bu iki maddeye cevap vermediğinden dolayı asetilkolin ile birlikte çalışıldı. Ayrıca ön kasılma oluşturulan dokularda ilaçların etkilerine bakıldı. İkinci aşamada, yine mezbahadan elde edilen sığır trakea epitel hücrelerinde tulatromisin ve gamitromisinin apoptoz ve nekroz yapıcı etkisinin değerlendirmesi için ikili boyama yöntemi ile hücre çekirdeğinin farklı renklerde boyanması ile apoptoz ve nekroz hücreleri belirlendi. Ayrıca bu antibiyotiklerin epitel hücrelerine sitotoksik etkileri MTT testi, hücre proliferatif etkilerini ise XCelligence gerçek zamanlı hücre analiz sistemi ile bakıldı. İzole trakea dokusu deneylerinde tulatromisin ve gamitromisin uygulama derişimlerinde sığır trakea izole kasında bir değişikliğe neden olmadı. 20 dakika 3x10-5 M tulatromisin, gamitromisin ve DMSO ile inkübe edilen izole kasına kümülatif ACh (10-8-10-3 M) derişimlerinin pD2 ve Emax değerlerinde istatistiksel olarak fark bulunamadı. 65 mM KCl ile ön kasılma oluşturulan dokuya kümülatif tulatromisin ve gamitromisin (10-10-10-5 M) ile DMSO cevapları arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunamadı. ACh'ın EC85 değeri ile ön kasılma oluşturulan sığır trakea düz kasında gamitromisin (10-7-10-6 M) kontrole göre dokularda daha fazla gevşemeye neden olduğu bulundu (P<0.05). 20 dakika 10-6 M gamitromisin ile inkübasyon, ACh'ın Emax değerini sayısal olarak azalttı (P?0.016). Hücre kültürü deneylerinde ilk MTT deneyi yapıldı. Tulatromisin ve gamitromisinin uygulandığı hücreler ait toksisite sonuçları bakıldığında trakea epitel hücrelerinde; gamitromisinin IC50 değeri 156±9 µg/mL, tulatromisinin IC50 değeri 134.7±7.1 µg/mL olarak hesaplandı. Gamitromisin ve tulatromisin aynı konsantranyonları karşılaştırıldığında 2 µg/mL, 4 µg/mL, 10 µg/mL, 20 µg/mL, 50 µg/mL, 150 µg/mL, 180 µg/mL ve 240 µg/mL'lik konsantrasyonlarının % canlılığı arasında önemlilik bulundu. Bu konsantrasyonlardan 150 µg/mL, 180 µg/mL ve 240 µg/mL'de gamitromisinin hücre canlılığı yüzdesi tulatromisine göre daha yüksek iken, 2 µg/mL, 4 µg/mL, 10 µg/mL, 20 µg/mL ve 50 µg/mL'de tulatromisin hücre canlılığı gamitromisinin göre daha fazla olduğu bulundu (P<0.05). İkili boyama yöntemi verileri istatistiksel olarak değerlendirildiğinde, 20 µg/mL'lik konsantrasyonda apoptotik % indeksi sonuçlarının arasındaki fark önemli olup, gamitromisinin tulatromisine göre daha fazla apoptoz yapıcı etkisi olduğu bulundu (P<0.05). Tulatromisin ve gamitromisinin trakea epitel hücreleri üzerine uygulanan 2 ve 10 µg/mL'lik konsantrasyonlarda zamana bağlı olarak canlılığın artığı gözlemlendi. Gamitromisin ve tulatromisin tek başlarına sığır trakea düz kas tonusunda değişikliğe yol açmazken, gamitromisin ACh ile ön kasılma oluşturulan dokularda az da olsa derişime bağlı olarak gevşeme etkisi göstermiştir. Bu etkinin pratik klinik uygulamalarında özellikle astım ya da solunum yolunda ödemle seyreden hastalıklarda tedaviye katkı sağlayabilir. Gamitromisin ve tulatromisinin trakea epitel hücrelerine sitotoksisitesi çok düşük olup güvenli bir şekilde kullanılabilir. Bu antibiyotikler arasında güven aralığı gamitromisinin daha yüksektir. Her iki antibiyotiğin apoptoz yapıcı etkileri; hücrelerin proliferasyon etkilerini artırarak, hastalık etkeninin ilk karşılaştığı yer olan epitel hücrelerini meydana gelebilecek hasarlara karşı koruyabilir. Gamitromisin ve tulatromisinin zamana bağlı olarak epitel hücre proliferasyonundaki artışı, bu antibiyotiklerin hastalık tedavisi sonrasında da koruyucu tedaviyi uzun süreli devam ettirebileceğini göstermektedir. Anahtar Kelimeler: Apoptoz, epitel hücresi, gamitromisin, nekroz, proliferasyon, sığır trakea düz kası, sitotoksisite, tulatromisin

The aim of this study was to investigate the effects of tulatromycin and gamithromycin in vitro on bovine trachea smooth muscle in isolated organ bath system; and apoptotic, necrotic and cytotoxic effects on bovine tracheal epithelial cells. The study was conducted in 2 stages. First the bovine trachea from the slaughterhouse was isolated as strips and suspended in the isolated organ bath. Cumulative dose response curve was obtained for gamithromycin and tulatromycin. As the tissues did not respond to these two substances, coincubation was studied acetylcholine. In addition, the effects of these drugs on precontracted tissues were examined. In the second stage, in the bovine tracheal epithelial cells were obtained from the slaughterhouse, cells with apoptozis and necrosis were determined by staining the cell nucleus in different colors by dual staining method to evaluate the effect of tulathromycin and gamithromycine on apoptozis and necrosis. In addition cytotoxic efects of these antibiotics on epithelial cells were examined by MTT test and cell proliferative effects were examined by XCelligence real time cell analysis system. In isolated trachea tissue experiments, tulatromycin and gamithromycin cumulative concentrations did not cause any change in isolated bovine trachea muscle. There was no statistically significant among in pD2 and Emax values of cumulative ACh (10-8-10-3 M) concentrations in isolated muscle incubated with 3x10-5 M tulatromycin, gamithromycin and DMSO for 20 minutes. There was no statistically significant difference between the cumulative tulatromycin and gamithromycin (10-10-10-5 M) and DMSO responses on the tissue which was precontracted with 65 mM KCl. Gamithromycin (10-7-10-6 M) caused more relaxation in tissues compared to control in bovine tracheal smooth muscle which was precontracted by the EC85 value of ACh (P <0.05). Incubation with 10-6 M gamithromycin for 20 minutes numerically reduced the Emax of ACh (P?0.016). First of all MTT assay was performed in cell culture experiments. When the toxicity results of tulatromycin and gamithromycin were evaluated, in tracheal epithelial cells the IC50 value of gamithromycin was 156±9 µg / mL and the IC50 value of tulatromycin was 134.7±7.1 µg / mL. The difference between gamithromycin and tulatromycin, at concentrations 2 µg/mL, 4 µg/mL, 10 µg/mL, 20 µg/mL, 50 µg/mL, 150 µg/mL, 180 µg/mL interms of cell viability was found to be significant. While the cell viability percentage of gamithromycin was higher at 150 µg / mL, 180 µg/mL and 240 µg/mL than tulatromycin; at 2 µg/mL, 4 µg/mL, 10 µg/mL, 20 µg/mL and 50 µg/mL concentrations tulatromycin cell viability was higher than gamithromycin (P <0.05). When the staining method data were evaluated, the difference between the results of % apoptotic index at 20 µg/mL concentration was significant and it was found that gamithromycin had more poptotic effect than tulatromycin (P <0.05). It was seen that tulatromycin and gamithromycin applied on tracheal epithelial cells at concentrations of 2 and 10 µg/mL; increased the viability depending on time. Gamithromycin and tulatromycin alone did not cause a change in bovine tracheal smooth muscle tone, while gamithromycin showed a slight relaxation effect due to the concentration on the tissues precontracted with ACh. This relaxation effect may contribute to treatment of asthma or respiratory edema in practical clinical applications. Gamitromycin and tulatromycin have very low cytotoxicity to tracheal epithelial cells and can be used safely. The confidence interval between these antibiotics is higher in gamithromycin. Apoptotic effects of both antibiotics, can protect the epithelial cells, which are the first place of the disease agent, against the damages by increasing the proliferation effects of the cells. The increase in epithelial cell proliferation of gamithromycin and tulatromycin due to time shows that these antibiotics can maintain long-term prophylactic treatment against diseases. Key words: Apoptosis, bovine tracheal smooth muscle, cytotoxicity, epithelial cell, gamithromycin, necrosis, proliferation, tulatromycin