Modifiye bioglass: Sert doku mühendisliği açısından in vitro ve in vivo etkinlik değerlendirmesi

Abstract

Bu tez çalışmasının amacı; yüzey modifikasyonu yapılan bioglass'ın in vitro ve in vivo çalışmalarla sert doku mühendisliği açısından etkinliğinin değerlendirilmesidir. Kemik doku mühendisliği uygulamalarında kullanımı olan bioglass belirli ölçüde osteokondüktivitesi ve biyouyumluluğu olan bir biyomateryaldir. Ancak bioglass'ın üretim tekniğine bağlı olarak biyouyumluluk ve osteoindüktivite kapasitesi değişmektedir. Biyomateryal canlı dokuya uygulandığında doku-biyomateryal ilişkisi ilk olarak biyomateryalin yüzeyinde gerçekleşir. Bu nedenle konak doku ile biyomateryal yüzeyi arasındaki fiziksel ve kimyasal etkileşimler biyouyumluluk üzerinde önemli bir rol oynar. Bu tez çalışmasında bioglass'ın biyouyumluluğunun ve osteojenik potansiyelinin arttırılması için yüzey modifikasyonu yapıldı. Üretilen bioglass yapay vücut sıvısı içerisine lizin, histidin, arjinin, fenilalanin, aspartik asit ve sisteinden oluşan amino asit karışımı katılarak elde edilen solüsyona maruz bırakılarak yüzey modifikasyonu gerçekleştirildi. Üretilen modifiye bioglass'ın FT-IR ve SEM incelemeleri ile fiziksel karakterizasyonu yapıldı. Modifiye bioglass'ın biyouyumluluğu ve etkinliği in vitro ve in vivo testlerle değerlendirildi. İn vitro olarak hücre canlılığını göstermek için yapılan MTT testinde modifiye bioglass'ın L929 ve MC3T3-E1 preosteoblastlar üzerinde sitotoksik etkisinin olmadığı ve hücre canlılık oranlarının 1:1 konsantrasyonda sırasıyla %84,64 ve %86,94 olduğu görüldü. MC3T3-E1 preosteoblastlarının hücre morfolojisini floresan mikroskopta değerlendirmek için yapılan Calcein AM testinde modifiye bioglass grubunda sferoid morfolojinin ve hücre canlılığının daha yüksek olduğu görüldü. Annexin V testinde apoptoz- nekroz oranlarının düşük olduğu (%98,23 ± 0,05 canlılık, %1,29 ± 0,15 apoptoz ve 0,46 ± 0,10 nekroz, 3.gün) görüldü. Genotoksisiteyi değerlendirmek için yapılan mikronükleus testinde çok düşük toksisite oranları belirlendi (3 saat uygulama için %1,36 S9 (+) ve %1,4 S9 (-), 24 saatlik uygulama için hesaplanan %1,56, p>0,05). Modifiye bioglass üzerine ekimi yapılan MC3T3-E1 preosteoblast hücrelerinin SEM görüntülerinde osteojenik farklılaşmasının ve hücre tutunmasının diğer gruplara göre daha iyi olduğu görüldü. Osteoblast farklılaşmasının erken belirteci olan ALP aktivitesinin modifiye bioglass grubunda daha yüksek olduğu (2,893 ± 0,514 ng/mL, p=0,036) tespit edildi. Alizarin Red S boyaması ile in vitro mineralizasyonun modifiye bioglass grubunda daha iyi olduğu, semikantitatif ve kolorimetrik olarak belirlendi (0,36 ± 0,012 mM, p=0,0003). İn vivo çıplak farelerde yapılan osteoindüktiv potansiyel testinde modifiye bioglass'ın osteoindüktif potansiyelinin %16,04 olduğu belirlendi. Ekstremite performans testi değerlendirmesinde modifiye bioglass'ın karşılaştırılan diğer gruplardan daha üstün olduğu görüldü (3 aylık değerlendirme skoru 6 (5-7), p=0,03). İmplantasyon sonrası lokal etki değerlendirmesinde ise irritan etkisinin bulunmadığı görüldü (Skorlar; 1 ay: 0,7; 2 ay: 0,43; 3 ay:0,2). Sonuç olarak bioglass yüzeyine amino asit karışımı içeren yapay vücut sıvısı ile yapılan yüzey modifikasyonunun biyouyumluluğu ve osteojeniteyi iyileştirdiği; bu çalışma kapsamında değerlendirilen modifiye bioglass'ın sert doku mühendisliği için umut verici bir biyomalzeme olduğu görülmektedir. Anahtar kelimeler: Modifiye bioglass, osteoindüktif potansiyel, yüzey modifikasyonu, genotoksisite, biyouyumluluk, implantasyon, MC3T3-E1.

The aim of this thesis study is to evaluate the efficiency of surface modified bioglass in terms of hard tissue engineering with in vitro and in vivo studies. Bioglass is a biomaterial with a certain degree of osteoconductivity and biocompatibility and, thus is used in bone tissue engineering. Biocompatibility and osteoinductivity properties of bioglass vary depending on the technique to synthetize bioglass. When the biomaterial is applied to living tissues, the tissue-biomaterial interaction first occurs on the surface of the biomaterial; therefore, the physical and chemical interactions between the host tissue and the surface of the biomaterial play a key role on biocompatibility. In this study, we aimed to modify bioglass surface to increase biocompatibility and osteogenic potential. Exposing to the simulated body fluid solution containing an amino acid mixture consisting of lysine, histidine, arginine, phenylalanine, aspartic acid and cysteine, the produced bioglass was surface modified. The surface modified bioglass was examined by FT-IR and SEM examinations. The biocompatibility and efficacy of the modified bioglass were evaluated by in vitro and in vivo tests. The MTT test, which was performed to evaluate cell viability in vitro, indicated that the modified bioglass did not exert a cytotoxic effect on L929 fibroblasts and MC3T3-E1 preosteoblasts with cell viability rates of 84,64% and 86,94%, respectively at the 1:1 dilution. Calcein AM test, a test to evaluate cell morphology of MC3T3-E1 preosteoblasts at a florescence microscope that indicated spheroid morhology and cell viability were higher in modified bioglass group. The Annexin V test revealed a low rate of apoptosis-necrosis with a cell viability rate of 98,23±0,05 and apoptotic and necrotic rates of 1,29% ± 0,15 and 0,46 ± 0,10, respectively at day 3. The micronucleus test to evaluate genotoxicity revealed very low toxicity rates; 1,36% S9 (+) and 1,4% S9 (-)for 3 hours and 1,56% for 24 hours , respectively (p>0.05). SEM images of MC3T3-E1 preosteoblast cells cultivated on modified bioglass showed that osteogenic differentiation and cell adhesion were better than the other groups. The ALP activity, which is an early marker of osteoblast differentiation, was higher in the modified bioglass group (2.893 ± 0.514 ng/mL, p=0.036). Alizarin Red S staining, an in vitro test to evaluate mineralization semi-quantitatively and colorimetrically, resulted in higher value in the modified bioglass group, (0.36 ± 0.012 mM, p=0.0003). In the osteoinductive potential test performed in nude mice in vivo, the osteoinductive potential of modified bioglass was determined to be 16.04%. The extremity performance test revealed that the modified bioglass was superior to the other groups (3-month evaluation score 6 (5-7), p=0.03). No local irritant effect was found after implantation (Scores; 1 month: 0.7; 2 months: 0.43; 3 months: 0.2). As a result, the surface modification process of the bioglass with a simulated body fluid containing an amino acid mixture applied to the bioglass surface improved biocompatibility and osteogenicity that indicates the modified bioglass evaluated within the scope of this study is a promising biomaterial for hard tissue engineering. Keywords: Modified bioglass, osteoinductive potential, surface modification, genotoxicity, biocompatibility, implantation, MC3T3-E1.