Karvakrolün insan dişeti fibroblast hücreleri üzerine etkilerinin in vitro değerlendirilmesi

Abstract

Periodontal hastalık, mevcut oral floranın disbiyozu nedeniyle periodonsiyumun yıkımına yol açan ilerleyici, enfeksiyöz bir enflamatuvar hastalıktır. Çeşitli bitki türevleri ve içerdikleri etken maddeler, patojenik mikroorganizmalara karşı antimikrobiyal etki göstermektedir. Bitkiler ve içerdikleri etken maddeler, periodontal sağlığın korunmasında eşsiz rol oynayan oldukça önemli özelliklere sahiptir. Karvakrol, kekik, biber ve yabani bergamot gibi aromatik bitkilerin uçucu yağlarında bulunan çeşitli hastalıklarda tedavi edici etkiye sahip antioksidan bir fenolik monoterpen bileşiğidir. Antibakteriyel, antifungal, antiviral, immün-modülatör ve antioksidan özellikleri birçok çalışmada araştırılmış ve farklı hastalıklar üzerinde terapötik bir etkiye sahip olduğu bildirilmiştir. Bu çalışmanın amacı dişeti fibroblastları üzerinde karvakrolün sitotoksik olmayan dozlarını belirleyerek, hücre canlılığı, apoptoz/nekroz oranı, reaktif oksijen türleri (ROT) aktivitesi, yara iyileşmesi ve Nrf2/Keap1 sinyal yolu üzerindeki etkilerini araştırmaktır. Dişeti fibroblast hücrelerinde oksidatif hasar oluşturmak için ajan olarak hidrojen peroksit(H2O2) kullanıldı. H2O2 ve karvakrolün farklı konsantrasyonlarda sitotoksik olmayan dozu belirlenerek hücre canlılığına etkisi tespit edildi. Bu uygulamalar için MTT test yöntemi kullanıldı. Daha sonra hematoksilen-eozin boyama ile hücre morfolojileri, double staining ile apoptoz/nekroz oranları, ROT aktivitesi ile oksidatif hasar şiddeti, immunositokimya (ICC) ile Nrf2 ve Keap1'in gen ekspresyonları incelendi. İki adet uygulama grubu oluşturuldu. Birinci uygulamada 24, 48 ve 72 saat sürelerde H2O2, karvakrol, H2O2+karvakrol ve kontrol şeklinde 4 farklı grup incelendi. İkinci uygulamada ise 24 saat H2O2+ 24 saat karvakrol ve 48 saat H2O2+ 24 saat karvakrol olmak üzere iki grup incelendi. MTT testi sonucunda, karvakrolün uygulama konsantrasyonu 20 µl olarak belirlendi. Bu konsantrasyonda karvakrolün hem toksik etki göstermediği hem de hücre artışına sebep olduğu gözlendi. Aynı yöntemle H2O2'nin 100 µM'luk konsantrasyonu kullanıma uygun olarak tespit edildi. H2O2 konsantrasyonu arttıkça hücre canlılığı yüzdesinin azaldığı ancak hiçbir dozda hücre canlılığının tamamen ortadan kalkmadığı gözlendi. 24,48 ve 72 saatlik uygulamalarda H2O2, karvakrol, H2O2+ karvakrol ve kontrol gruplarında yapılan incelemede, H2O2 'nin tek başına uygulandığı hücrelerde ROT ile boyanma tespit edilirken diğer gruplarda ROT aktivitesi izlenmedi. Uygulamalar sonrasında hücrelerin morfolojisi ışık mikroskobu ile değerlendirdiğinde karvakrolün 24, 48 ve 72 saat uygulanması sonucunda hücrelerin morfolojik bütünlüğünü koruduğu, ayrık sitoplazma içi granüllerin, hücre yıkımlarının olmadığı ve hücre çoğalmasında azalma olmadığı tespit edildi. H2O2 ve karvakrolün bir arada uygulandığı gruplarda ise 24 ve 48. saatte herhangi bir yıkım gözlemlenmese de 72. saatin sonunda hafif yıkımların başladığı ve morfolojinin değişmeye başladığı gözlendi. Double staining metodu ile apoptoz/nekroz oranı değerlendirildiğinde, H2O2 uygulanan gruplarda nekroz oranı yüksekken karvakrol uygulanan gruplarda bu oranın sıfıra indiği gözlendi. H2O2 ile oksidatif stres oluşumu sonrasında karvakrol uygulanan gruplarda ise nekroz oranının düşüp apoptoz oranlarının arttığı gözlendi. Ayrıca in vitro çizik yara iyileşme modeli ile karvakrolün hücre proliferasyonunu artırdığı ancak yara iyileşmesi için yara bölgesine hücre göçünü sağlamadığı tespit edildi. ICC ile inceleme sonucunda ise oksidatif hasar oluşturulmuş hücreler üzerine karvakrol uygulanmasının Nrf2 ve Keap1 gen ekspresyon düzeylerinde artışa yol açtığı ve artan oksidatif stres karşısında bu artışın daha şiddetli bir şekilde gerçekleştiği tespit edildi. Sonuç olarak, 20 ?M dozunda uygulanan karvakrolün diş eti fibroblast hücrelerinde canlılık düzeyini ve apoptoz/nekroz oranını artırdığı ayrıca ROT aktivitesini azaltarak ve oksidatif hasar karşısında oluşan Nrf2 ve Keap1 gen ekspresyon düzeylerini artırarak oksidatif hasarın inhibe edilmesinde etkin bir rol oynadığı tespit edildi.

Periodontal disease is a progressive, infectious inflammation disease, caused by the dysbiosis of oral resident flora, leading to the destruction of periodontium. The pathogenic microorganisms is the etiological factor of periodontal disease, while the immuno-inflammatory response affects the progression of the disease. Herbs and their active ingredients have some remarkable benefits and valuable properties that play an irreplaceable role in the maintenance of periodontal health. Carvacrol is an antioxidant phenolic monoterpene compound found in essential oils of aromatic plants such as thyme, pepper and wild bergamot, which has a therapeutic effect on various diseases. Its antibacterial, antifungal, antiviral, immune modulator and antioxidant properties have been investigated in many studies, and many studies have reported that carvacrol has a therapeutic effect on different diseases. The aim of this study is investigate the effects of carvacrol on effective dose, cytotoxicity, cell viability, apoptosis, wound healing, oxidative stress and Nrf2/Keap1 signaling pathway by in vitro studies on gingival fibroblasts. As gingival fibroblast cells, cells obtained by the research team from previous studies used. Cell viability and cytotoxicity test determined by MTT method. Dose adjustment applied at different concentrations in the MTT test. After determining the effective concentration of carvacrol and H2O2, reactive oxygen species (ROS) levels determined in order to determine the changes that may occur in oxidative stress by applying it to the cells where oxidative stress is created. Immunohistochemistry staining applied to the cells in order to examine the effects of carvacrol on the Nrf2 and Keap-1 pathways as a result of the application of carvacrol to the cells in which oxidative stress is created with H2O2. Double staining test performed for cell apoptosis analysis. Cell migration and wound healing assessed using a scratch wound analysis, which measures the expansion of a population of cells on surfaces.