Yeni akrilat kökenli afinite kürelerin tasarlanması: Protein adsorpsiyonu ve saflaştırılmasında kullanılması

Abstract

Bu tez çalışmasının ilk bölümünde, afinite kromatografisi uygulamalarında dolgu maddesi olarak kullanılabilecek farklı özelliklere sahip, monodispers p(glisidil metakrilat-etilenglikoldimetakrilat), p(GMA-EGDMA), partikülleri dispersiyon polimerizasyon tekniği ile hazırlandı. Farklı özellikteki ligandların IgG'ye karşı afinitesini belirlemek üzere glutarikdialdehit kullanılarak modifiye edilen p(GMA-EGDMA) partiküllerine L-histidin amino asidi (L-his), Kongo Kırmızısı (CR) boya ligandı ve Cu(II) iyonlarının şelatlanması amacı ile üç dişli iminodiasetik asit (IDA) ligandı yüzeye kovalent olarak bağlandı ve modifiye partiküllerin sulu çözeltiden IgG adsorpsiyonu araştırıldı. Hazırlanan üç farklı özellikteki monodispers afinite partiküllerin karakterizasyon çalışmaları (spesifik yüzey alanı, yoğunluğu, şişme oranı, mikroskop görüntüsü, FT-IR spektrumu, DSC ve TGA analizi ve yüzey aktif grupların tayini) tamamlanarak sulu çözeltilerden IgG proteininin adsorpsiyon davranışı araştırıldı. Adsorpsiyon koşullarının (pH, adsorpsiyon denge süresi, iyonik şiddet, sıcaklık, başlangıç protein derişimi gibi) monodispers partiküllerin IgG adsorpsiyon performansına etkileri incelendi. Bununla birlikte, adsorpsiyon kinetiği ve izoterm modeli ile monodispers afinite partiküllerin yeniden kullanılabilirliği gibi parametreler de belirlendi. Monodispers p(GMA-EGDMA)-L-his, p(GMA-EGDMA)-CR ve p(GMA-EGDMA)-İDA-Cu(II) partikülleri için maksimum adsorpsiyon kapasitesi sırası ile pH 7.0, 6.0 ve 7.5'de gözlendi. En yüksek adsorpsiyon kapasitesi, p(GMA-EGDMA)-İDA-Cu(II) partiküllerinin kullanıldığı sistemde 32.87 mg/g olarak belirlendi. Afinite partiküllerin adsorpsiyon kapasitesinde önemli bir azalma olmadan adsorpsiyon-desorpsiyon işlem döngülerinde yeniden kullanılabilirliği belirlendi.Tez çalışmasının ikinci bölümünde, biyolojik molekül ile etkileşimini incelemek üzere yeni manyetik özellik kazandırılmış akrilat kökenli afinite polimerik partikülleri hazırlandı. Bu doğrultuda, afinite kürelere farklı bir monomerin kopolimerizasyonu ve/veya monomerin yüzeyde aşılanması ve manyetik özellik kazandırılması gibi işlemlerle farklı özellikler kazandırılarak adsorpsiyon tekniği ile tripsin enzimi immobilizasyonu çalışmaları gerçekleştirildi. Manyetik p(glisidilmetakrilat-metilmetakrilat), mp(GMA-MMA), polimerik destek materyali süspansiyon polimerizasyon tekniği ile hazırlandı. p(GMA-MMA) mikrokürelerinin epoksi grupları, magnetizasyon reaksiyonu sırasında amin gruplarına dönüştürüldü. p(GMA-MMA) mikrokürelerinin yüzeyine metakrilik asit (MAA) monomeri aşı kopolimerizasyon reaksiyonu ile aşılandı ve manyetik p(glisidilmetakrilat-metilmetakrilat)-g-(metakrilik asit), mp(GMA-MMA)-g-MAA, mikroküreleri elde edildi. Yüzeyine metakrilik asit aşılanmış manyetik kürelere tripsin enzimi adsorpsiyon yoluyla immobilize edildi. Manyetik kürelere tripsin adsorpsiyonuna sistem parametrelerinin (başlangıç tripsin konsantrasyonu, ortam pH ve sıcaklığı) etkisi ve immobilize enzimin aktivitesindeki değişim belirlendi.Maksimum adsorpsiyon pH 7.0'de elde edildi. Maksimum immobilizasyon kapasitesinin 2.0 mg/ml enzim konsantrasyonunda 123.2 mg/g olduğu ve başlangıç aktivitesinin yaklaşık %84.2'sini koruduğu belirlendi. İmmobilize tripsinin desorpsiyonu, 1.0 M NaCl çözeltisi içeren 1.0 M formik asit çözeltisiyle gerçekleştirildi. Sonuçlar, manyetik p(GMA-MMA)-g-MAA küreleri üzerine adsorplanan tripsinin aktivitesinde kayıp olmaksızın tekrar tekrar kullanılabileceğini gösterdi. Belirlenen optimum adsorpsiyon koşullarında manyetik p(GMA-MMA)-g-MAA mikrokürelerine immobilize edilen tripsin enziminin sitokrom c ve insan serum albümini (HSA) proteinlerini parçalama etkisi HPLC yardımıyla belirlendi.

At first chapter in this thesis, monodisperse poly(glycidylmethacrylate-ethyleneglycoldimethacrylate), p(GMA-EGDMA), particles will be used as packing materials in affinity chromatography applications were prepared by dispersion polymerisation. In order to determine specifity of the different properties of affinity ligand to IgG, L-histidine (L-his) amino acid, Congo Red (CR) dye ligand and Cu(II) metal ions subsequently derivatized iminodiacetic acid (IDA) chelating were then covalently immobilised on monodispers p(GMA-EGDMA) particles using glutaricdialdehyde as a coupling agent. The performance of modified particles on IgG adsorption from solution was investigated. Furthermore, characterizations of monodispers affinity particles (specific surface area, density, swelling ratio, microscopic picture, FTIR spectrum, DSC and TGA analysis and determination of surface active groups) were determined and adsorption behavior of IgG was invastigated from solutions. Adsorption conditions (such as pH, equilibrium adsorption time, ionic strength, temperature, initial protein concentration) were search on performance of IgG adsorption. However, parameters such as adsorption kinetics, isotherm models and reuse of affinity particles were determined.The monodisperse p(GMA-EGDMA)-L-his, p(GMA-EGDMA)-CR, p(GMA-EGDMA)-İDA-Cu(II) affinity particles maximum adsorption capacity of IgG was found at pH 7.0, 6.0 and 7.5 respectively. The highest adsorption capacity was obtained with p(GMA-EGDMA)-İDA-Cu(II) particles and maximum adsorption capacity was found 32.87 mg/g. The IgG molecules could be repeatedly adsorbed and desorbed with monodisperse affinity particles without noticeable loss in their IgG adsorption capacity.At the second chapter in this study, in order to invastigate of interaction with biological molecule, a new acrylate based polymeric affinity beads were synthesized. For this purpose, magnetic poly(glycidylmethacrylate-methylmethacrylate), mp(GMA-MMA) beads were prepared via suspension polymerization in the presence of ferric ions. The epoxy groups of the poly(GMA-MMA) beads were converted into amino groups during magnetization reaction, and then were grafted with methacrylic acid (MAA) via graft copolymerization. Magnetic mp(GMA-MMA)-g-MAA microbeads were found. The enzyme trypsin was immobilized on the magnetic beads via adsorption. The effect of system parameters (initial trypsin concentration, pH and temperature of media) of trypsin adsorption on magnetic beads and change of immobilized enzyme activity were determined.The maximum adsorption was obtained at pH 7.0. At 2.0 mg/mL initial trypsin concentration, the maximum immobilization capacity was 123.2 mg trypsin/g beads and retained about 84.2% of its initial activity. The immobilized trypsin could be desorbed by 1.0M formic acid solution containing 1M NaCl. The usability and efficiency of the immobilized trypsin for protein digestion were tested with two different model proteins (i.e.,HSA and cytochrom c) with HPLC.