Primer kornea epitel hücre kültüründe Uv-A ve Uv-B'nin antioksidan aktivitesinin moleküler biyolojik araştırılması

Abstract

Keratokonus, henüz sebebi bulunamamış ve oluşumundaki sebepleri incelenmeye devam eden bir göz hastalığıdır. Epitel ve stroma hücrelerinde yüksek seviyede UV ışınlarına maruzat sebebiyle oksidatif stres yoğun olarak yaşanır ve bu hücreler güçlü bir antioksidan sisteme sahiptir. Keratokonusta oksidatif streste artış gösterilmiş olsa da, antioksidan mekanizmadaki değişiklikler bu tez ile açığa çıkarılmıştır. Keratokonus ile ilgili henüz genetik bir sebep bulunamamasına rağmen çevresel etkenlerden en önemlisi güneş ışınlardaki yüksek enerjili mor ötesi (UV) ışınların gözde ciddi etkiler oluşturmasıdır. Güneş ışınlarındaki yüksek enerjili UV ışınları üç kısma ayrılır ve en yüksek enerjili olan UV-C atmosferde soğurularak yeryüzüne neredeyse hiç ulaşmaz. UV-B çoğunlukla kornea epitel ve stroma hücrelerinde, UV-A ve kalan UV-B'nin de tamamı lens tarafından soğurulur. Kornea epiteli hücreleri UV-B'ye doğrudan maruz kalan ilk hücre tabakasıdır ve olumsuz etkilerin önlenmesi için yüksek miktarda antioksidan molekül ve enzim ifadesi bulunmaktadır. Keratokonuslu hücrelerde DNA hasarı durumu incelenmiş fakat önemli bir fark bulunamamıştır. Antioksidan enzimlerinin miktarları ve aktiviteleri de hem normal-keratokonuslu kornea epitel hücrelerinde hem de UV-A/B ile maruz bırakılan epitel hücrelerinde incelenmiştir. Enzim olmayan moleküller de oksidatif stres ile mücadelede UV emilimi açısından önemli bir rol oynar. Keratokonuslu epitel hücrelerinde bu moleküllerin azalması veya UV-A/B maruzatı ile ifade değişikliğinin bulunmaması sorun olabileceği şüphesini çıkartır. Çalışmalar kapsamında enzim olmayan antioksidan moleküller glutathione, C-vitamini, E-vitamini, NADPH ve Ferritin incelenmiştir. Epitel hücre kültürlerinin normaller ile ve UV-A/B maruzatı durumu ile karşılaştırmalı olarak toplam antioksidan kapasitesi incelenmiştir. Bunun yanı sıra, aynı şekilde antioksidan aktiviteleri ve miktarları açısından incelenen enzimler SOD-1, SOD-2, ALDH, Catalase, G6PD, Glutathione Peroxidase, ve Glutathione Reductase enzimleridir. Antioksidan enzimlerinin transkripsiyon ya da translasyonun hangi aşamasında problem oluşturduğunun anlaşılması için ise hem qPCR analizleri hem de protein seviyesinde ELISA testleri gerçekleştirilmiştir. Antioksidan mekanizmasının son ürünleri olan NO sentaz, NO, H2O2 ve NADH miktarları da incelenmiştir. Tüm bu analizler sayesinde keratokonus hastalığının epitel tabakadan kaynaklanabileceğine dair önemli bulgular elde edilmiştir.

Keratoconus is an eye disease with limited findings about its prognosis and progression. Epithelial and stromal cells are highly exposed to UV of sunlight which causes oxidative stress and thus these cells have to possess high degree of anti-oxidant mechanisms. By this project, abnormalities in antioxidant mechanisms of epithelial cells are revealed. Although there is limited findings about genetic background of Keratoconus, effect of high energy UV of sunlight has strict effect on cornea cells. There are three subtypes of sunlight UV and UV-C, with highest energy, absorbed through atmosphere. UV-A and UV-B, however, reaches cornea and absorbed by both epithelial and stromal layers, and eye lens. Corneal epithelial cells are first layer of cells exposed to UV-A/B and its antioxidant mechanism is well developed. Amount and activity rate of antioxidant enzymes, both in normal and epithelial cells and UV-A/B exposed cells. Non-enzyme molecules, also, have an important role for absorbance of UV. Down-regulation of these molecules of unaltered expression after high dose UV-A/B exposure in Keratoconus provides information about a problem. Non enzyme molecules, glutathione, C-vitamin, E-vitamin, NADPH and Ferritin have been investigated. The other enzymes are SOD-1, SOD-2, ALDH, Catalase, G6PD, Glutathione Peroxidase, and Glutathione Reductase. To understand better about the point of problem during transcription and translation, both qPCR and ELISA methods have been applied. The end products of antioxidant mechanism, NO synthase, NO, H2O2 and NADH quantities are also measured. By all these analysis, it is reached that keratoconus disease can also be originated at cornea epithelial layer.